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Puriney's Notes

Puriney=purine+Y, my Wonderland

 
 
 

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【bio】下调基因表达的思考  

2011-11-17 01:14:34|  分类: Bio |  标签: |举报 |字号 订阅

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【引子】
最近在思考本人课题(其实一直在思考),拨开课题特例本身,牵扯到一个小问题,而这个问题我个人感觉是有普遍性地(虽然对于一般的基因工程而言多余的)。基因下调,效果究竟是作用在一个细胞而言还是一群细胞而言的。

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简单而言,RNA splicing里有个有趣的设计,叫做NMD(Nonsense-Mediated mRNA Decay)。cassette exon,是不一定被剪切进入mRNA的exon,是相对于constitutive exon(组成性exon)而言的概念。

【bio】下调基因表达的思考 - Puriney - Purineys Notes
 
如果cassette exon本身有stop codon的三碱基序列,splicing过程中它本身发生inclusion,即最后的mRNA里包含这个cassette exon。而且巧合的是,在最后mRNA的整个ORF里,cassette exon的stop codon序列确实行使stop codon功能,那可想而知,整个mRNA在翻译蛋白时,翻译过程将提前在这个意外stop codon里停下来,进而整个mRNA、整个蛋白质的完整性就被破坏了。相反地,如果这个cassette exon被skipping了,那么完整的蛋白将会表达。

这样的exon我形象地称呼它为“毒性exon”。

这个现象对于蛋白质而言并不是绝对的坏事情,反而是基因调控的优良策略。具体不展开。

要达到基因表达水平的下调,策略有很多,可以是直接的miRNA或者siRNA,也可以是利用基因之间的此消彼长之关系。但是似乎,任何基因调控策略,最终都无外乎要回到这个问题:

任何下调(或上调)基因的影响,是作用在单个细胞水平?还是在一群细胞水平?

【bio】下调基因表达的思考 - Puriney - Purineys Notes
figure_1: 单个细胞的基因水平下调
如figure1,这就是典型的单细胞水平下调基因表达。我以某种策略来干扰某个exon是否inclusion或者skipping。发现按照这种策略,有70%的毒性exon发生skipping了,mRNA功能完整、蛋白完好无损,基因开启(ON)。而另一方面30%的毒性exon发生inclusion,mRNA被毒害继而蛋白破损,基因关闭(OFF)。

所以可以看见,单个细胞水平而言,胞內存在两种mRNA,一种是完好mRNA、一种是被毒害的mRNA。因为完整mRNA的水平就只有70%,继而单个细胞就只有70%的表达量。


【bio】下调基因表达的思考 - Puriney - Purineys Notes
figure_2: 单个细胞基因表达命运的决定
如figure2,在这种实验基因下调策略之下,一定概率性地抑制了毒性exon的skipping。与figure1里的单细胞不同,此时每个细胞里只存在一种mRNA,要么是完整mRNA,要么是被毒害mRNA。与其说这种策略是一种对基因的下调,不如说是细胞命运的真·决定。

看了下面的对比图figure3也许你可以理解这个蛋疼问题的生物意义:

【bio】下调基因表达的思考 - Puriney - Purineys Notes
figure_3:二者的巨大区别
 A和B是代表一坨细胞或者一个菌落(所以你并不知道具体每个细胞的情况),假设这些细胞都表达GFP而发绿光。经过你设计的基因下调策略处理,你确确实实看见,相对于WT,基因表达水平变成了70%,成功被下调了。但是,你能分辨出究竟是单细胞都表达70%(如A),还是只有70%的细胞表达了蛋白(如B)?究竟是所有细胞都成功被弄二了呢,还是只是因为你人品好有倒霉的30%细胞中招了?

阴性对照、阳性对照、挽救(rescue)策略,这三种常见的对照策略,都无济于事。那么,怎么半?

难道只能单细胞测序了么?

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【后记】
1. 我之所以说一般基因工程是根本不care这些问题,是因为最终结果里基因表达水平被下调就好了。我之所以再说,这样的研究很危险,是因为如果不关心具体情况,很有可能其实是假象,正如figure_3B所示,万一造成那30%被下调的原因是偶然?或者是其他原因呢?(所以此刻重复实验有意义了)

2. 目前“市面上”有很多所谓determine cell fate的研究,要我说,其实很多都是如图figure1的研究,太极拳似的、中药似的来决定细胞命运,就是慢慢磨死你;如果真·细胞命运决定,就应该像figure2那样,立竿见影,要细胞向东走,绝对不会“西北-北-东北”慢慢转向东边,而是直接一个后空翻向东。

不过怎么做真·命运决定呢?我暂时没想到。而且可悲的是,我还不能找到让自己信服这样做的意义。毕竟无奈就像找妹子一样,死缠烂打厚脸皮纠缠才是王道。

3. figure1-3自己绘图,忘记附上中文了。

4. 如果能有办法做出判断,那合成生物学就能做出来。如果能确定对单细胞有效果,那就能做出真·调控装置;如果确定是拼概率,那就能做真·命运决定装置。不论哪样做,synbio都可以做出有意义的装置
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